今天將為大家介紹的是手工細胞計數(shù)法。因為在細胞培養(yǎng)技術(shù)中，細胞計數(shù)應(yīng)是一項基本功，對于標準化培養(yǎng)條件以及需要精確定量的實驗來說都非常關(guān)鍵。

下面即是手工細胞計數(shù)的基本流程、原理和意義：

1.計數(shù)前首先準備好細胞計數(shù)器（血球計數(shù)板）：

使用70%乙醇將蓋玻片和細胞計數(shù)板清潔、晾干備用。
將晾干的蓋玻片輕輕覆蓋至血細胞計數(shù)器上。

（注：使用前須保證蓋玻片和計數(shù)板已充分晾干，否則將影響后續(xù)細胞充池及計數(shù)結(jié)果。）

2.制備細胞懸液：

對于貼壁生長的細胞，我們需要首先使用胰酶消化的方法使細胞從培養(yǎng)皿表面脫落。（懸浮細胞則無需消化，稀釋到合適倍數(shù)即可。）

然后加入適當(dāng)?shù)暮迮囵B(yǎng)基，中和胰酶的作用并重懸細胞，以得到均質(zhì)的細胞懸液。要求盡可能將細胞吹散，不要殘留任何細胞團，但不可用力過大。

（注：消化太過或消化不全均會使計數(shù)結(jié)果產(chǎn)生偏差。）

臺盼蘭染色（可選）：
如果需要計算細胞的活率，則需要將細胞懸液和0.4%臺盼蘭等體積混合；

室溫孵育3-5分鐘（懸浮細胞染色時間可視情況適當(dāng)延長），使臺盼蘭全部進入死細胞，使死細胞著藍色。

3.充池：即血細胞計數(shù)器加樣

使用吸管或移液器將細胞懸液或細胞/臺盼蘭混合液滴加到計數(shù)池的邊緣。此時液滴將在虹吸的作用下進入蓋玻片下方的計數(shù)池，此即為充池。

（注：若需進行多個樣品的計數(shù)，應(yīng)盡量保證每次充池的體積一致，一般在10μl/池左右。）

以同樣的方式在另一側(cè)的計數(shù)池中也加入計數(shù)樣品。

將計數(shù)板靜置幾分鐘使細胞擴散、沉降。

4. 細胞計數(shù)：

在100倍顯微鏡下，移動計數(shù)板將視野對準計數(shù)板的中央大方塊，該方塊四周有一圈3條平行線包圍，中間有密集的網(wǎng)格。中央方塊區(qū)差不多剛好可以填滿整個視野（圖1中標記的3號位置）。

                     圖1.細胞計數(shù)板圖解

分別計數(shù)大方格1.2.4.5中的細胞數(shù)。（為降低計數(shù)誤差，最好將細胞濃度調(diào)整為20-50個/大方格。）并重復(fù)記錄另一側(cè)計數(shù)池中的細胞數(shù)，總計8個大方塊，然后取均值。

計數(shù)原則為：“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右"。（判斷標準為是否接觸三條邊線的中間線，如圖2所示）。

                                      圖2. 細胞計數(shù)原則

如果有多個細胞沒有吹散而成團存在，此時只可記為一個細胞。如果團塊很多，則需重新吹打甚至重新取樣消化直至絕大多數(shù)細胞為單個細胞。

5. 細胞濃度計算：

                                             圖3. 樣品充池體積圖解

由圖3可以得出，每個大方格的容積為：

1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 =10-4 cm3= 10-4 ml
即每個大方格的容積為萬分之一毫升，因此在計算每毫升液體中的細胞數(shù)時需乘以104。

在常規(guī)沒有使用臺盼蘭染色時，可以以下面公式計算每毫升樣品中細胞的個數(shù)：
每毫升樣品中細胞的個數(shù) = 每個大方格內(nèi)細胞的平均數(shù) × 細胞稀釋倍數(shù)×104

如果使用了臺盼蘭染色，還需要計算活細胞的百分率：
活細胞百分率（%）= 臺盼蘭拒染細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100

此時活細胞數(shù)的計算公式為：
每毫升樣品中活細胞的個數(shù) = 每個大方格中細胞的平均數(shù)×活細胞比率×細胞稀釋倍數(shù)×2×104
注：乘2是由于在臺盼蘭染色時，進行了等體積混合，相當(dāng)于稀釋了一倍。

看了以上步驟和原理，大家不禁會問：我們?yōu)槭裁匆獢?shù)細胞??？細胞計數(shù)究竟有什么意義呢？其實，當(dāng)我們想了解細胞的生長情況時，除了直接觀察細胞形態(tài)以外，繪制細胞生長曲線、計算細胞倍增時間應(yīng)該就是廣泛采用的評價指標了。

所以盡管使用血細胞計數(shù)板手工計數(shù)細胞過程十分繁瑣，對實驗者操作者的要求也比較嚴格，現(xiàn)在也已有很多自動化的細胞計數(shù)器/儀，但對于科學(xué)研究中遇到的各種細胞而言，手工計數(shù)仍然是易行的方法而被廣大實驗室采用。

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